PCR primerlarini qanday loyihalash mumkin

Polimeraza Zanjir reaktsiyasi (PCR) - bu tadqiqot, tibbiy va sud-tibbiyot sohalarida turli xil qo'llanmalarga ega bo'lgan usul. Bu kuchaytiradi DNK qiziqish parchasi. Shuningdek, bu kasallik tashxisi va genotiplash uchun sezgir sinovdir. Reaktsiya tizimining asosiy tarkibiy qismlariga DNK kiradi shablon , tamponli eritma, deoksiribonukleozid trifosfat ( dNTPlar ), Taq polimeraza va bir juft astarlar (oldinga va orqaga). To'g'ri ishlab chiqilgan astarlar eksperimentga sarflangan vaqt va vaqtni kamaytiradi. Primer-BLAST - bu shablonga xos bo'lgan astarlarni topish uchun kuchli vositadir. Ushbu vositadan foydalanish bepul va dasturlarni o'rnatish yoki dasturlash ko'nikmalarini talab qilmaydi. Ushbu maqola Primer-BLAST misolida PCR astarlarini qanday loyihalashni ko'rsatib beradi.

Tayyorlanmoqda

Tayyorlanmoqda
Primer-BLAST veb-saytiga o'ting (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). E'tibor bering, RefSeqga kirish afzal qilingan shablon formatidir. Reference Sequence (RefSeq) to'plami - GenBank asosiy ma'lumotlar bazasidan ortiqcha ma'lumotlarga ega bo'lmagan ikkinchi darajali ma'lumotlar bazasi.
  • Primer-BLAST - bu Milliy Biotexnologiya Axborot Markazi (NCBI) tomonidan ishlab chiqilgan va uni loyihalash uchun vositadir.
  • NCBI, molekulyar biologiya ma'lumotlari uchun milliy manba sifatida, biologiya ma'lumotlar bazalarini yuritadi va bunday ma'lumotlar bazalaridan foydalanishni osonlashtiradi.
  • Biologik tadqiqotlar natijasida olingan barcha genetik ma'lumotlar oxir-oqibat NCBI tomonidan saqlanadigan ma'lumotlar bazasiga joylashtirilganligi sababli, Primer-BLAST har qanday organizm uchun mos parametrlar tanlangan vaqtgacha mos keladi.
Astarlarning maqsadini aniqlang. Maqsad astar dizayniga ta'sir qiladi. PCR mahsulotining uzunligi va astarlarning joylashuvi kabi parametrlar ko'p jihatdan maqsadga bog'liq. Bu butun genni kengaytirish yoki gen mavjudligini tekshirish, yoki uning ifoda darajasini aniqlash yoki boshqa maqsadlar uchunmi?
  • Bir misol keltiring. Drosophila melanogaster (umumiy mevali chivin) organizmdagi p53 o'simta bostiruvchi genga qiziqish paydo bo'lsin.
  • Maqsad ushbu genning ifoda darajasini aniqlashdir.
  • Bunday holda, primerlar genom o'rniga teskari transkripsiya qilingan qo'shimcha DNK (cDNA) xabarchi RNK (mRNA) bilan bog'lanadi. Shunday qilib shablon p53 kodlash ketma-ketligiga (CDS) qadar torayadi.
Tayyorlanmoqda
PCR shablonini biling. Manbai nukleotiddan iborat ketma-ketliklar tadqiqotning turli vaziyatiga qarab o'zgaradi. U ketma-ketlik natijasida hosil bo'lishi yoki ma'lumotlar bazasidan olinishi mumkin. Agar bu ketma-ketlik natijasi bo'lsa, to'g'ridan-to'g'ri "Raw Sequence for BLAST Running" qismiga o'ting. Agar u ma'lumotlar bazasidan bo'lsa, bir muncha vaqt ushbu bazada o'ynang.
  • Drosophila melanogaster p53 genida, izohlangan ketma-ketlik NCBI ma'lumotlar bazasida mavjud.
  • NCBI bosh sahifasiga o'ting (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • Kalit so'zlarni qidirish satriga kiriting. Ushbu satrda AND, OR, NOT kabi mantiqiy operatorlar qo'llanilishi mumkin.
  • Drosophila melanogaster p53 geni haqidagi ma'lumotni qidiring va izlang.
Tayyorlanmoqda
Ma'lumotlar bazasida joylashgan ketma-ketliklar uchun ro'yxatdan o'ting. Primer-BLAST shablonni xom DNK ketma-ketligiga qaraganda RefSeq qo'shilishi bilan yaxshiroq aniqlaydi. RefSeq dasturiga kirishning yana bir afzalligi - bu funktsiyalar bilan bog'liq exon / intron faqat PCS shablon sifatida RefSeq mRNA ketma-ketligini kiritishda mavjud.
  • Agar ketma-ketlik onlayn bazadan olingan bo'lsa, shunchaki RefSeq ga kirish uchun NCBI bosh sahifasidagi kalit so'zlarni qidirib toping.
  • Keyin "Xom ketma-ketligi uchun BLASTni ishlatish" qismini o'tkazib yuboring va to'g'ridan-to'g'ri "Parametrlarni sozlash" bo'limiga o'ting.

Xom ketma-ketligi uchun BLASTni ishga tushirish

Xom ketma-ketligi uchun BLASTni ishga tushirish
Birlamchi qo'shilish uchun RefSeq ma'lumotlar bazasiga kirish. Tegishli RefSeq dasturiga kirish orqali Basic orqali kirish mumkin Mahalliy hizalama Qidiruv vositasi (BLAST). RefSeq qo'shilishini topish xom ketma-ketlikning NCBI ma'lumotlar bazasini o'sha xom ketma-ketlikka o'xshash ketma-ketlikni qidirishni anglatadi.
  • Misol bilan davom eting. Namoyish qilish uchun deylik, Drosophila melanogaster p53 geni izohlanmagan. O'zining ketma-ketligini bilish uchun Drosophila ma'lumotlar bazasiga o'ting (http://flybase.org). "Gen" qatoriga o'tishda "p53" so'zini kiriting. U o'sha genga yo'naltiriladi. Drosophila melanogaster p53 genining CDS-larini toping.
  • BLAST veb-saytini oching (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
  • Bu holda DNK ketma-ketligini boshqa DNK ketma-ketligi bilan moslashtirganligi sababli BLAST nukleotidini bosing.
Xom ketma-ketligi uchun BLASTni ishga tushirish
Ketma-ketlikni nusxalash yoki Flybase-dan FASTA-ni yuklab olish. FASTA bioinformatikada nukleotid kodlarini saqlash uchun standart formatdir. Deyarli barcha matnni qayta ishlash vositalari ushbu fayl turini ochishi va tahrir qilishi mumkin.
Xom ketma-ketligi uchun BLASTni ishga tushirish
BLASTni ishga tushiring. CDS-ni so'rovlar ketma-ketligi qutisiga joylashtiring. Mahalliylashtirishni amalga oshirish uchun pastga aylantiring va BLAST ni bosing.
Xom ketma-ketligi uchun BLASTni ishga tushirish
Belgilangan shablonga mos keladigan RefSeq qo'shilishini tanlang. BLAST natijasida keltirilgan ma'lumotlarga e'tibor bering. Tegishli kirishni aniqlang.
  • Ko'rinishidan, moslashtirish identifikatori 100% bo'lishi kerak, chunki RefSeq qo'shilishi maqsad shablonni namoyish etadi.
  • Agar 100% identifikatsiya bilan urish bo'lmasa, bu so'rovlar ketma-ketligi yaxshi o'rganilmaganligini anglatadi. Bunday holda Primer-BLAST uchun xom ketma-ketlikdan foydalaning. Biologiya ma'lumotlar bazasiga hissa qo'shish uchun ushbu yangi ketma-ketlikni GenBank-ga saqlang.
  • Yana bir muhim nuqta - bu organizm va ketma-ketlik nomini aytib beradigan tavsifga mos kelish.
  • Masalan, RefSeq NM_001170223.1 va uning ostidagi mos keladigan moslamalar mavjud. Ulardan birini tanlash yaxshidir.
Xom ketma-ketligi uchun BLASTni ishga tushirish
Belgilangan mos yozuvlar ketma-ketligi va maqsadli shablon uchun juft yo'nalishda hizalang. Shuni yodda tutingki, mos keladigan qo'shilish bilan mos yozuvlar ketma-ketligi odatda mo'ljallangan shablon bilan bir xil uzunlikka ega emas. Bir-biriga mos keladigan hizalama aynan bir xil mintaqani topishi mumkin.
  • EMBL-EBI-da (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/) juftlikni ketma-ketlik bilan tekislash moslamalari veb-saytiga o'ting.
  • Mahalliy hizalama algoritmini tanlang.
  • Drosophila melanogaster p53 genining ifoda darajasini aniqlash misolida NM_001170223.1 ketma-ketligini nusxa oling va qutilarga joylashtiring; p53-RC CDS boshqa oynada.
  • Dasturni ishga tushirish uchun "yuborish" tugmasini bosing.
Xom ketma-ketligi uchun BLASTni ishga tushirish
Ikkala parcha hizalanadigan joylarni mos yozuvlar ketma-ketligiga yozib qo'ying. Hizalama ustidagi birinchi va oxirgi raqam ikki bo'lakning hizalanadigan boshlanish va tugash nuqtasini bildiradi.
  • Misolda, natija p53-RC CDS 630dan boshlanadi va NM_001170223.1 ketma-ketligining 1787-chi nukleotidida tugashini ko'rsatadi.
  • Mahalliylashtirishni amalga oshirishning sababi shu erda. EMBI-EBI-da moslashtirish vositasi natijani matn shaklida qaytaradi. Joylarni panjara holda hisoblash qiyin. Qulaylik bilan, mahalliylashtirilgan hizalanish natijasi, tenglashtirilmagan hududlarni qoldirib, to'g'ridan-to'g'ri hizalanmış pozitsiyalarni ko'rsatadi.

Parametrlarni sozlash

Parametrlarni sozlash
PCR shablonini ma'lumotlarini Primer-BLAST-ga kiriting.
  • Masalan, RefSeqga kirish NM_001170223.1.
  • Lavozimdan oldinga yo'naltirilgan primer - 630.
  • 1787 holatiga teskari astar.
  • Yuqoridagi ikkita parametr p53-RC ning CDS mintaqasidagi chegarani qamrab oladi. Agar shablon BLAST xom ketma-ketligidan olingan RefSeq a'zosi bo'lmasa, ular keraksizdir.
Parametrlarni sozlash
Primer parametrlarini sozlang. Primer-BLAST-da, tizim avtomatik ravishda standartdan farq qiladigan parametr qiymatlari sariq rangda ta'kidlanadi.
  • Misoldagi gen ifoda darajasini aniqlash uchun nisbatan qisqa PCR mahsuloti kifoya qiladi.
  • Shunday qilib, PCR mahsulotining minimal va maksimal o'lchamlari mos ravishda 100 va 250 ga o'rnatiladi.
Parametrlarni sozlash
Exon / intron tanlovini rostlang. Ushbu qadam genomik DNK astarini loyihalash uchun zarur emas. Ammo bu cDNA primer dizayni uchun juda muhimdir, chunki bu tadqiqotchiga kelajakdagi tajribalarda cDNA namunasida genomik DNK bilan ifloslanish mavjudligini tekshirishga imkon beradi.
  • Masalan, shablon cDNA bo'lganligi sababli, intron qo'shimchasini yoqing.
  • Genom DNK cDNA shabloniga qaraganda uzoqroq PCR mahsulotiga ega bo'ladi.
Parametrlarni sozlash
Primer Pair o'ziga xosligini tekshirish parametrlarini sozlang. Organizm nomini kiriting, shunda dastur tegishli ma'lumotlar bazasini qidirishi mumkin. Qat'iylik uchun, nomuvofiqliklar qancha ko'p bo'lsa va mo'ljallanmagan maqsadlarni e'tiborsiz qoldirish uchun mos kelmaydigan narsalar soni qanchalik ko'p bo'lsa, primer o'ziga xosligi qanchalik qattiq bo'lsa.
  • Misolda organizm Drosophila melanogaster hisoblanadi
  • 6 - bu Primer-BLAST ruxsat bergan eng ko'p mos kelmaslik
  • Astarning 3 'uchidagi mos kelmaslik sezgir. Bu rejalashtirilmagan maqsadlarni samarali bajarishga majbur qiladi.
  • Belgilanmagan maqsadni aniqlash uchun ushbu dasturning chegarasi 35% gacha mos kelmasligi, ya'ni 20 ta nukleotidli primer uchun 7 ta mos kelmasligi.
Parametrlarni sozlash
Advanced parametrlari menyusini oching.
Parametrlarni sozlash
Astar parametrlarini optimallashtiring. The GC tarkibi 40-60% oralig'ida erigan harorat Qabul qilinadigan poli-X ning maksimal qiymati 4. Bir xil asosning ketma-ket nukleotidlaridan saqlanish kerak. Max Poly-X ni noto'g'ri sozlash imkoniyatini 3 ga kamaytiring.
Parametrlarni sozlash
Primer dimmerlaridan saqlanish uchun o'z-o'zini va juftlikni to'ldirishni maksimal darajada kamaytiring. PCR reaktsiyasining dastlabki tsikllarida shablon konsentratsiyasi astarlarga qaraganda ancha past bo'ladi, agar primerlar o'z-o'zidan bog'lanib qolishsa, nukleotid zanjirining bo'shashishini boshlash uchun oz sonli astarlar shablonga bog'lanadi. Primerlarda qo'shimcha nukleotidlar sonini cheklash samaradorlikni oshiradi.

Astarlar olish

Astarlar olish
Tayyorlangan astarlarni yarating. Primer nomzodlarini olish uchun pastga aylantiring va "Primerlarni olish" tugmachasini bosing. Odatda dasturni ishga tushirish uchun 2 daqiqadan kam vaqt ketadi. Ba'zan, ayniqsa ish vaqtida, tanaffus to'liq quvvat bilan ishlaydi. Bu so'rovlarni kutish ro'yxatiga kiritadi va natijani olish uchun yarim soatdan ko'proq vaqt ketishi mumkin. Maslahat shoshilinch soatlarning oldini olishdir.
Astarlar olish
Ushbu nomzodlardan 2-3 juftni tanlang. Bir juft avval sintez qilinadi. Qolgan juftliklar zaxira vazifasini bajaradi. Nomzodlardan zaxira astarlarni tanlayotganda, o'xshashlarga qaraganda farqli juftlarni tanlash yaxshidir. Agar primer juftliklaridan biri eksperimental testda past samaradorlik yoki o'ziga xoslikka ega bo'lsa. Shunga o'xshashlar, ehtimol, xuddi shunday muammoga duch kelishlari mumkin.
  • Drosophila melanogaster p53 genining ifoda darajasini aniqlash misolida, qaytarilishi kerak bo'lgan primer juftlari soni 10 standart qiymatiga o'rnatiladi. Dastur 10 nomzod primer juftligini beradi.
  • Nomzodning primerlari tushuntirish maqsadida turli xil ranglarda guruhlangan. Primer-BLAST tomonidan yaratilgan asl natija faqat bitta rangga ega.
  • Agar qizil rangdagi astar avval sintez qilingan bo'lsa, lekin tajribada muvaffaqiyatsiz bo'lsa, yashil, sariq yoki qora rangdagi astarlar zaxira nusxasi bo'lishi mumkin.
  • Ammo zaxira sifatida primer juftliklarini ko'k rangda tanlamagan ma'qul, chunki qizil astar va ko'k ranglar orasida ziddiyat mavjud.
Sintez qilingan primerlarning sifatini eksperimental ravishda tekshiring. Sintez qilingan astar juftliklaridan foydalanib, PCR-ni ishga tushiring. Jelni tahlil qilish orqali uning samaradorligi va o'ziga xosligini sinab ko'ring elektroforez natija yoki yuqori aniqlik eritish tahlili (HRMA). Agar primerlar sinovdan o'tmasa, zaxira juftligini sintezlang va mos juftlik topilmaguncha tekshirish bosqichini takrorlang.
  • Elektroforezning yuqori yorqinligi yoki HRMA flüoresanligi sinovdan o'tgan astarlarning samaradorligini ko'rsatadi.
  • Elektroforezda yoki HRMAdagi bitta erish cho'qqisida yagona bog'lanish sinov qilingan astarlarning o'ziga xosligini ko'rsatadi.
  • Misolda, primerlar miqdoriy PCR (qPCR) uchun mo'ljallangan. Astarlar sifatini tekshirish uchun qPCR samaradorligini aniqlash protokoliga amal qilish muhimdir.
Lug'at (alifbo tartibida)
  • hizalama identifikatsiya: ikkita hizalanadigan ketma-ketlikda bir xil kodlarning foizi
  • izohlangan ketma-ketlik: funktsiyalari va joylashuvlari aniqlanadigan identifikatsiya qilinadigan ma'lumotlarning ketma-ketligi
  • bir-birini to'ldiruvchi: nukleotid bazasini bog'lash o'rtasidagi xususiyat, ganin (G) tsitozin (C) va adenin (A), timin (T) yoki Uracil (U) bilan juft.
  • DNK: deoksiribonuklein kislotasi, deyarli barcha organizmlarda genetik ma'lumotlarni olib yuradigan nukleotidlarning polimer molekulasi. Ko'pgina DNK molekulalari ikki qatorli. Har bir ipning 5 va 3 'uchlari bor. Ikki qo'shimcha iplar bir-biriga qarama-qarshi ravishda tekislanadi va spiral hosil qiladi
  • dNTP: DNK sintezining substrati. Bitta dNTP molekulasida azot asosi, deoksiriboz va uchta fosfat guruhi mavjud
  • elektroforez: turli xil molekulalarni ularning o'lchamlari va zaryadlariga qarab ajratish usuli
  • exon: genning yakuniy mahsulotida ifodalanadigan har qanday qism
  • GC tarkibi: ketma-ketlikda guanin (G) va sitosin (C) foizi
  • genom: organizmning umumiy genetik moddasi
  • intron: genning yakuniy mahsulotida ifoda etilmagan har qanday qismi
  • mahalliy hizalama: bioinformatikadagi ikkita ketma-ketlikning o'xshash segmentlarini aniqlang. Mahalliy hizalama ikkita ketma-ketlikning butun uzunligini tenglashtirishga harakat qiladigan global hizalanishga tegishli
  • erish tahlili: harorat gradienti ostida ikki qatorli DNK tarqalishi natijasida hosil bo'lgan egri chiziqni aniqlaydigan, so'ngra DNKning xususiyatlarini bilish uchun egri chiziqni baholaydigan jarayon.
  • mRNA: genni ifoda etishda oraliq o'yinchi bo'lib xizmat qiluvchi RNKlar oilasi. mRNA ma'lumotni DNKdan oqsil mahsulotiga o'tkazadi
  • nukleotid: nuklein kislotasi polimerining monomer birligi. Bitta nukleotid tarkibida azot asosi, besh karbonli qand va fosfat guruhi mavjud
  • polimeraza: nuklein kislota polimer sintezini katalizlaydigan ferment
  • astar: DNK polimer cho'zilishining boshlang'ich nuqtasi bo'lib xizmat qiladigan nuklein kislotaning qisqa ipi. Sintez qilingan parcha oldinga va teskari astar o'rtasida joylashgan, chunki zanjirning cho'zish yo'nalishi har doim 5 'dan 3' gacha.
  • RNK: ribonuklein kislotasi, genlarni kodlash, tartibga solish va ifoda etishda turli rol o'ynaydigan polimer molekulasi. Ko'pgina RNK molekulalari bitta simli. Har bir ipning 5 va 3 'uchlari bor
  • shablon: nusxa ko'chirish uchun asl ketma-ketlikni ta'minlaydigan DNK tarmog'i.
  • transkripsiya: DNK ketma-ketligini uning qo'shimcha RNKiga ko'chiring
Qidiruv parametrlarini ma'lum bir shablon turi uchun optimallashtirilganidan keyin saqlash juda foydali. Bu keyingi safar takrorlanadigan mehnatdan qochishga yordam beradi.
benumesasports.com © 2020